前言
荧光显微技术需要高发光强度来激发荧光团,同时产生足够强的发射光谱,用于捕获细节度高、亮度强的样品图像。LED照明系统在成本、功能和环保方面优点颇多,已经取代汞灯和金属卤素灯成为荧光显微镜的现代照明之选。第一代LED照明系统于2006年上市,从此作为荧光显微镜光源的LED在照明性能方面有了突飞猛进的提高。随着LED技术的不
断发展,发光强度也不断提高。
如今,LED被视作一项成熟的技术,但有一个问题仍显落后——业内还未对光强度的测量设定标准方法。这使得显微镜工作者无法精确比较照明系统和显微镜配置。没有定量基线,就不可能规范性能要求和改进配置系统。本白皮书旨在理清与光照强度相关的混淆术语。我们将提出正确的术语和行业标准方法,供显微镜工作者在样品平面上轻松量化所需的强度。有了这些高价值的数据,可以对所有照明系统和显微镜配置进行直接比较,使所有科学领域的显微镜学家能够优化他们的系统以满足研究需求。
何为发光强度?
荧光显微镜照明的产品规格或与之相关的讨论中提到发光强度时,通常未清楚指明“发光强度”具体是什么。尤其是,目前还未有标准化的强度测量方法。首先,让我们说明强度一词的含义。有几个关键术语需要在此定义：
强度:
单位面积功率,可以指任何种类的功率（电、热、光等）,测量单位是瓦特/平方米（W/m2）。
辐射强度:
不要将之与强度混淆,以瓦特/球面度（W/sr）为单位测量单位球面度的功率（即每单位锥角发射的功率）
辐照度:
单位面积表面的辐射功率,单位为毫瓦/平方毫米（mW/mm2）。这是我们的首选术语,避免了强度和辐射强度之间的任何混淆。
功率的概念也经常被提及,以瓦特为单位,但不考虑面积,功率可以根据照明面积的大小产生很大的变化。如果不了解这种能量集中在给定表面区域的效率,这个值在很大程度上是没有意义的。因此,我们选择以辐照度来测量到达样品的光量,单位为毫瓦/平方毫米（mW/mm2）。
对此,我们需要考虑一个问题：从哪里测量辐照度？举个例子,一些制造商会引用LED芯片的功率,这是最吸引眼球的统计数据。然而,这些数字极具误导性,因为它们不能代表到达样本的光量（图1）。
另一种常见的方法是引用标准3毫米液芯导光管的功率,其数值孔径为0.58。不过,这仍然是不准确的,因为基于锥角,并非所有离开导光管的光都可以在样品平面被捕获。引用光纤的功率可能会导致类似的不准确性（虽然误导程度较低,因为光纤通常具有较小的芯直径和较小的数值孔径)。未使用液体导光管或光纤的光源所发出的功率数据所得的辐照度是错误的。更糟的是,测量数据的误差让同类对比错上加错。
在显微镜照明中,唯一重要的光是撞击样品激发荧光团的光。因此,测量光源光功率的唯一有意义的地方是在样品平面。这里,我们指的是以毫瓦/平方毫米为单位测量的辐照度。在辐照度计算中,引用物镜以及相机或目镜的视场来考虑表面积（参见第三页的“规则”部分）。只有这种方法才能提供准确的数值,作为比较不同显微镜配置和照明系统的基线。请参见第三页测量样品平面辐照度的推荐规则。
图1：为什么要在样品平面测量辐照度。 当光从LED传播到样品时,每一步都会损失一部分光,例如经过液体导光管时,如右栏所述。因此,在样品平面上游的任何点测量光的数据都具有误导性。
测量辐照度的规则
在CoolLED,我们引用了一款常用荧光显微镜样品平面的辐照度值,例如Olympus BX51显微镜,物镜为10倍（0.3NA）或40倍（0.85NA）。我们建议将以下规则作为行业标准。
1.从激发块上移除激发滤光片,并以明镜代替二色镜。这意味着我们是在样品平面测量未过滤的光。这样做是因为使用多个滤光片会影响功率。知道了未经过滤的总功率和LED光谱传播,用户就可以在选定的滤光片就位的情况下计算样品的功率。业内信誉良好的滤光片制造商会为每个滤光片提供传输数据。
2.使用校准过的光谱仪测量样品平面的功率。我们还使用积分球或余弦校正器来获得与探测器上光线入射角无关的功率结果。
3.进行测量时,关闭显微镜视场光阑,使样品平面上的视场光阑图像正好在视场之外。这确保了照射到样本平面上的光仅由给定物镜视场内的光线组成,如目镜或具有给定视场的照相机。这样做消除了物镜可能遗漏但未进入视场的光,且通过消除视场光阑引起的任何可变性实现了更精确的测量。
3.按照产品说明书的步骤,光谱仪中产生功率数值后,使用样品平面的表面积计算辐照度。
a.以毫米为单位确定直径 = 视场（fn） /物镜放大率Mo）。
b.使用公式πr2计算表面积,单位为mm2。
c.使用表面积和功率读数以毫瓦/平方毫米（mW/mm2）表达辐照度。均匀性良好的情况下,整个样本平面上数值是统一的
结论
随着LED照明技术的发展,“发光强度”的讨论也愈演愈烈。在本文中,我们认为使用辐照度一词对于避免其与强度和辐射强度的混淆至关重要。当提到发光强度时,例如在产品规格中,应该对该术语的确切含义提出疑问。由各种术语和测量技术引起的混淆已经阻碍了我们确认哪些照明系统能够真正向样品平面传递最多的光。对此,我们现在强烈建议使用更具价值的、在样品平面测量所得的辐照度值,并以我们在本文件中描述的规则为测量标准,为显微镜学者提供一种比较辐照度的方法,并在需要时提高辐照度。LED的作用越来越大,我们相信这一趋势在未来几年还会继续。我们期待显微镜界能够通过一种稳健的标准化辐照度量化方法来实现与时俱进。
自2006年为荧光显微镜推出首个LED照明系统以来,CoolLED一直致力于LED光源的发展与创新,为科研人员和临床工作者带来最先进的LED照明。与传统汞灯和金属卤素灯相比,LED光源更稳定、持久、可控和节能,并且安全环保,是不二之选。
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