对于小动物活体荧光成像领域来说，基于近红外荧光检测的技术是最佳的。原因有二，第一，红外荧光具有更高的信噪比，生物组织自发荧光发射波长在500-540nm之间(如黑色素500-520nm，血红蛋白504-540nm)，在650nm以上自发荧光则逐渐降低。第二，近红外光可进行更深层的成像。生物组织在近红外附近(650-900nm)光吸收较弱; 而且相对于可见光，近红外光的衰减长度更长，意味着在组织内穿透力更强【图1】。这使得成像深度可达厘米级，有报道近红外成像深度最高可达皮肤下20mm[1]。目前结合各种化学小分子近红外荧光探针，小动物近红外成像在肿癌生物学领域发挥了广泛而巨大的作用，是药物筛选，诊断治疗，预后评估的利器。

图1．在近红外光范围，生物组织的自发荧光吸收和散射均较低，光衰减长度则更长[1]。

 

相对大量开发出来的小分子探针而言，生物研究者似乎更期待近红外荧光蛋白的出现，这样我们可以利用分子生物学技术，如同操纵绿色荧光蛋白GFP那样，玩出各式花样。然而并不容易，基于GFP为代表的传统荧光蛋白的激发光波长一直无法突破650nm。最终，在GFP被首次应用于成像的近20年后，人们才终于在细菌光敏素(Bacterial phytochrome photoreceptors，BphPs)上开起了近红外荧光蛋白研发的历史[2]。实际上光敏素是一个大家庭，存在于细菌，蓝藻，藻类及植物中，能吸收红光和近红外光。它在植物中的作用非常有趣，红光使其活化，可促进种子发芽或开花等；而近红外光相反，使其钝化。植物和藻类的光敏素所必需的生色团在高等动物细胞内不存在，而恰恰是细菌光敏素的生色团bili- verdin IXa (BV)广泛存在于好氧生物内，这当然包括了各种动物细胞。这似乎是细菌为生物医学研究者提供了一个大礼，然而问题来了，普通细菌中的光敏素发射荧光太弱了！因此在合适的菌种中发现并改造优化光敏素的想法付诸实践了。

 

2009年，钱永健(Roger Tsien)实验室在Science杂志上报导了第一个可用的近红外光敏素荧光蛋白。他们从抗辐射奇异球菌Deinococcusradiodurans中选择了光敏素与生色团结合区域，并做了D207H突变，产生了第一代近红外荧光蛋白IFP1.0。进而突变优化产生了更加稳定的实用新版本IFP1.4，无需外源导入生色团就可以达到1.0版的4倍亮度，激发光波长684nm，发射光波长708nm[3]。当这第一扇门被打开后，更多的近红外荧光蛋白开始涌现，广泛应用于多色荧光成像，光转换，蛋白相互作用报告子等方面的研究[4]。结合共聚焦，双光子，核磁共振等断层摄影术，近红外荧光蛋白在基础科研，药物筛选及临床前实验等领域发挥着越来越重要的作用【图2】。我们有信心期待更多的基于近红外荧光的细胞生理活动指示蛋白的出现，获取更深更清淅的生理信号。

图2．近红外荧光蛋白的在成像领域的各种应用[4]。

 

除了可用于深层高质量成像外，近红外蛋白也发展成为重要的光遗传蛋白相互作用的控制工具。此前基于光氧电压蛋白LOV、隐花色素Cryptochromes等蛋白的光控蛋白相互作用体系多采用短波长的蓝光激发，一方面易于GFP等蛋白相交叉，另外活体穿透力有限。日前，爱因斯坦医学院的研究者发明了基于光敏素的近红外光控蛋白相互作用体系。他们发现在沼泽红假单胞菌(R. palustris)中，其光敏素(RpBphP1)与转录抑制因子RpPpsR2在近红外光刺激下结合形成异源二聚体，且无酶反应活性，这两个蛋白正是合适的近红外控制蛋白相互作用的工具[5]。如图3所示，他们构建两个质粒。第一种为PpsR2、VP16融合mVenus荧光蛋白，并具有核定位信号NLS的质粒(NLS-PpsR2-VP16)，在细胞核内表达。另一种为含TetR的光敏素BphP1融合mcherry红色荧光蛋白质粒(BphP1-mCherry-TetR)，在胞浆中弥散性表达。将这两个质粒与pTRE–Tight–SEAP质粒共转至HeLa细胞中。当740nm的光照到细胞上数分钟，BphP1结合PpsR2，使得胞浆中红色荧光蛋白富集到细胞核内，并启动tetR-tetO转录系统，使得胞内SEAP基因表达在48小时内增加40倍。黑暗环境则可使其两个蛋白解聚，636nm可加速此逆过程。利用此系统可轻易控制各种蛋白结合和分离，以及调控细胞器的运动等。另外结合TetR-TetO系统，可以光控蛋白转录，实现对特定基因表达的光遗学控制。

图3．近红外光控制BphP1进入细胞核并启动转录系统。

 

一句话，近红外蛋白的出现和发展有望在深层分子成像及光遗传领域引发小小的革命，为临床前诊断，动物药理学试验及靶点发现等多方面带来便利。

 

参考文献：

1. J Lecoq & M Schnitzer, Nature Biotechnology,2011.

2. JWagner et al., J. Biol. Chem. 2008.

3. X Shu etal., Science, 2009.

4. D Shcherbakova et al., Current Opinionin Chemical Biology, 2015.

5. AKaberniuk et al., Nature Methods, 2016.