光片（Light-Sheet）显微镜因为其光毒性和光漂白低、成像速度快^1-4，已经被越来越多的实验室用于做发育样品和透明化样品的成像。光操作（包括光烧蚀/光损伤、光固定、光遗传学、光漂白、光转化、光活化等），很多人可能并不陌生，因为其在共聚焦显微镜上已经取得广泛应用。但是，光片显微镜和光操作的结合的应用还不多。2020年，来自欧洲分子生物学实验室（EMBL）的Matteo Rauzi和Lars Hufnagel课题组（以下简称为“课题组”）联合在Scientific Reports期刊上发文，详细介绍了把多视角（Multiview）光片显微镜与三大类光操作的结合⁵。

一光烧蚀/光损伤

课题组首先用光烧蚀做了果蝇发育的实验。这是4个处于有丝分裂第7期的果蝇胚胎，各有128个细胞。各对其中1个果蝇胚胎的1个细胞（红点指示的）进行光烧蚀，即用1025nm的脉冲激光对其照射。结果这4个细胞都没能到达胚胎的皮层（没有移动到圆周上），而同期的其他细胞却没有受到这个影响。标尺长度50μm。

接着，课题组在受精后第5天的斑马鱼胚胎的大脑上做了光烧蚀的实验，如下（标尺长20μm）。红色箭头指向的是被烧蚀的神经元的胞体；黄色的是具有神经元修复功能的小胶质细胞。视频的这个小胶质细胞，从23μm远的地方，以3μm/min的速度赶过来修复神经元。

更好玩的是，当课题组把1个神经元的轴突烧蚀之后（红色箭头所指），4个小胶质细胞（黄色）火速赶来，对它进行修复。

二光固定

研究组依然用了果蝇胚胎来做实验。在胚胎表面的光烧灼能够把目标细胞拴在卵黄膜上。而且这种作用只对上皮细胞和卵黄有效。右边的、用红色箭头标注的细胞被牢牢拴在卵黄膜上不动，而左边的、用绿色箭头标注的细胞随着胚胎发育移动了。标尺长度100μm。

三光遗传学

然后，研究组在果蝇胚胎上做了光遗传学（即用光来控制某个现象的发生）的实验，如下图。这里，研究组用了系统：CRY2-CIB1。该系统会在特定光照下消耗果蝇的细胞皮层上的肌动蛋白。在下图中，位置1和位置3没有接受激光照射，发育正常；位置2接受照射后形成了明显的腹侧的沟状结构。

同样用CRY2-CIB1去激活Rho通路，研究组也观察到在有无光刺激的区域的发育的不同（下图）。位置1和3没有被光活化，而位置2被光活化。

最后，附上课题组所用显微镜的光路示意图。从中可以看到，把一个多视角（Multiview）光片显微镜和光操作结合起来，要比共聚焦显微镜和光操作的结合复杂得多。

Luxendo已经把光操作模块（PM）整合到MuVi光片显微镜中。下图是MuVi 搭载光操作模块的正面和俯视图。红色框标注的部分为光操作模块，其中蓝色盒子为激光，黑色盒子为光学部件。MuVi PM可选的激光组合包括以下三种：

• 单个红外脉冲激光，1030-1040nm，200fs脉冲宽度，1.5W，可用于光损伤/光烧蚀等应用
• 最多两个连续二极管激光，波长405-685nm，最高100mW，可用于光活化、光漂白、以及光遗传学等应用
• 单个连续或者脉冲激光，780nm，100fs脉冲宽度，最高500mW，可用于光活化, 以及光遗传等应用

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参考文献：

1. 2004, Science, Jan Huisken et al.

2. 2008, Science, Philipp J. Keller et al.

3. 2008, HFSP Journal, Emmanuel G. Reynaud et al.

4. 2013, Journal of Biophotonics, Matthew Jemielita et al.

5. 2020, Scientific Reports, Gustavo de Medeiros et al.