酪氨酸磷酸化修饰是关键的蛋白翻译后修饰方式之一，在细胞信号转导通路中发挥了重要作用，其异常调控与多种严重的疾病息息相关，如肿瘤。磷酸化修饰方式在人体内负责添加磷酸基团的蛋白酪氨酸激酶（Protein Tyrosine Kinases, PTKs）和负责催化磷酸基团离去的蛋白酪氨酸磷酸酶（Protein Tyrosine Phosphatases, PTPs）可逆调控。由于PTKs的研究技术手段较为成熟，研究者们广泛揭示了PTKs在相关疾病发生中的作用机制，并在此基础上进行了系列药物的研发，目前，已经有20多种PTKs相关药物在临床上应用。PTPs也是很多疾病治疗及药物开发的靶点，然而由于研究技术的限制，PTPs的功能阐述以及与底物相互作用的解析尚浅，极限制了相关疾病治疗的进展。

图1 非天然氨基酸的设计及作用机制

在这篇文章中，作者设计通过PTPs和底物蛋白的共价交联反应机制，即利用PTPs对底物蛋白的识别和结合亲和性，拉近其活性位点半胱氨酸与底物特定磷酸化位点上的ncAAs的距离，从而促进两个氨基酸的化学反应形成共价交联复合体，捕获作用于已知底物蛋白磷酸化位点的未知PTPs（图1a, b），根据磷酸酶共价抑制剂结构及作用机理，合成设计了一系列具有不同反应活性的酪氨酸类似物，称为非天然氨基酸(noncanonical amino acids，简称ncAAs)，如图1c所示。

磷酸酶和底物蛋白的共价交联反应首先在体外实验中得到了验证。在大肠杆菌中，将ncAAs通过基因密码子扩展技术被编码到底物蛋白ABL1特定磷酸化位点上，进行纯化及质谱验证，同时表达PTP家族蛋白SHP2的催化结构域。ABL1和SHP2在适当反应条件下，能够发生明显的共价交联反应，形成两分子复合物（图2a），说明该方法具有可行性。

图2 共价交联反应在体外和细胞内的验证

进而，共价交联反应在活细胞中获得了验证。这些ncAAs都能有效的编码到真核细胞表达蛋白的特定位点（图2b），因此，以已知相互作用的SHP2和原癌基因人类表皮生长因子受体2(Human Epidermal growth factor Receptor 2，HER2)的磷酸化位点Y1023作为研究对象，利用该方法，通过免疫共沉淀和western blot检测，可以清楚的观测到SHP2-HER2两分子复合物，说明此方法可以用于验证底物蛋白和PTPs的相互作用。

图3 底物特异性磷酸化酶的鉴定

最后，作者结合此方法和蛋白组学分析，建立了用于探索作用于已知底物蛋白的磷酸化位点的PTPs。以HER2的磷酸化位点Y1221为例，在活细胞中过表达在1221位点上带有ncAAs的HER2，裂解细胞进行免疫共沉淀，再通过SDS-PAGE分离出共价复合物，并通过蛋白组学分析，发现了催化该位点进行去掉磷酸基团的酶，即PTP1B (Protein Tyrosine Phosphatase 1B)，这也是第一次对PTP1B与HER2直接相互作用的报道（图3）。

刘涛研究员，生于1982年。博士，博士生导师，天然药物及仿生药物国家重点实验室独立PI，北京大学药学院特聘研究员。北京大学百人计划，国家中组部青年千人计划入选者。发表科研论文20余篇，其中以第一作者或者通讯作者的身份在J Am Chem Soc, Cell Chem Biol, PNAS, Angew Chem, J Med Chem, ACS ChemBiol, 等一系列杂志上发表高水平论文14篇，申请国际专利两项。团队研究方向以蛋白大分子生物工程，化学修饰以及细胞的信号转导研究为主。研究团队运用化学生物学，合成生物学和转化医学的研究方法，以遗传密码子扩展技术和分子文库筛选技术为核心，突破大自然中蛋白质是由20种天然氨基酸所组成的局限，并将其应用到蛋白大分子制药和阐明疾病的发生发展机理领域，为生物药物的升级换代和开发新的治疗靶点奠定基础。