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LED光源在荧光显微成像中的应用简介

发布时间:2016-03-25 浏览量:369

荧光显微镜中的LED光源具有便利与绿色环保的优点。这些LED能够保持研究成分的有效性,特别是对成像和敏感样品的保存。
LED技术在我们的生活中发挥越来越重要的作用。在过去的50年里,该技术的应用已从简单的电子产品指示灯扩展到替代白炽灯以节约大量能源。LED具有高强度、使用寿命长、可控制性及光谱输出稳定的特点,因此发展出了一些不为大家所熟知的专业照明应用。

图1. 荧光显微镜的基本构造

将荧光显微镜中的灯泡替换成LED已大大降低了其运行成本。这种技术在生命科学中广泛用于单细胞或多细胞生物标本的研究。该研究涉及到使用光学显微镜(图1)激发出特定波长的光。通过一种被称作为斯托克斯(Stokes)位移的过程,例如荧光光谱和拉曼光谱,重新激发出更长波长的光。斯托克斯位移即相同电子跃迁吸收和发射光谱带顶位置之间波长或频率单元的差异。
使用不同的荧光团来标记样品,即在不同的区域使用不用的荧光颜色,则可形成高对比度的多色照片(图2)。

图2. 使用CoolLED公司pE-300white拍摄的带有荧光标记的皮肤图像

满足光谱需求
一些研究中需要使用活细胞成像,另一些需要使用被化学试剂固定于某一特定生命时期的细胞。不论何种情况,用于照明样本的光源的类型和设计对显微镜所需的硬件以及所记录图像的质量和有效性都有极大的影响。
早期使用LED系统的一个重要原因在于使用者及实验室负责人的便利性。最常见的灯泡,例如100W高压汞灯,其寿命很短,约为300小时。使用者通常会在记事本上记录打开灯泡的时间,因为若使用灯泡的时间过长,则会增加爆炸的风险。然而,LED产品的使用寿命长达数万小时。

灯泡的使用需要预热与冷却的时间,且在一整天内都要打开。而LED光源可以在需要的时候以电子方式打开或关闭,即在观察样本或拍照期间打开光源,不使用期间可以关闭。尽管使用LED替代灯泡的优点很多,但由于存在高强度及光谱范围这两个主要问题,LED的应用发展停滞不前。
由于LED光源的复杂性和成本,其发出的光不是宽光谱而是包含多达六个离散波长的高斯(Gaussian)光谱,并且具有约10nm至40nm的半峰宽(FWHM)。因此光源设计人员需要使用多个LED来满足研究人员的光谱需求,这将产生新的光电和机械设计的复杂性,且这些问题对于传统灯泡光源来说是不存在的。研究人员需要捕捉和校准LED芯片的朗伯发射,然后使用二色镜组合出多种颜色。朗伯定律表明,从漫反射表面观察到的发光强度与入射光方向和表面法线之间的角度θ的余弦成正比。
一种新颖且已获得专利的方法采用了波长分组概念,即具有相近光谱的LED波长为一个用户可选择的通道。根据对高速应用的需求,合并具有相近光谱的四个LED。关键是要认识到,某些波长接近的分组,在相同的样本中很少会用到。如今,研究人员可以使用包含高达16个波长的LED光源,使用这种方法能够改善LED的强度、谱段范围,也能够降低成本。


目前可以使用的LED芯片的功率与100W汞灯泡中等离子弧产生的辐射相差甚远。灯泡能够发射极宽谱段范围的能量,但在给定的约20nm的谱段范围内,LED更有优势甚至超过了汞灯泡在360nm至800nm的大部分区域。
LED的过度使用在荧光应用领域非常常见,这使热量管理变得极为重要。冷却技术包括珀尔帖(Peltier)冷却以及将未封装的LED芯片放置在大型铜散热片上。
长期以来,光谱的绿光区域与灯泡相比最弱,这部分区域在固态照明中被称为“绿色空白”,也是LED光谱中极其微弱的区域。研究人员可以通过采用多种形式的荧光材料来解决这一问题。一种由飞利浦公司(Philips)取得专利权的方法使用由一系列明亮蓝色LED组成的荧光棒。与单个LED相比,在常见的荧光显微镜上使用这种方法会增加成本且实用不方便。对蓝色LED芯片功率的最新研究提出了更为简单的解决方案,即在LED上直接放置荧光剂,且只选择能够提供最大绿色光谱区域的荧光剂。图3中展现了由明亮绿色LED通过斯托克斯位移激发的红色光。

图3. 使用荧光标记的牛肺动脉内皮细胞。蓝色区域为细胞核,绿色区域为微管蛋白,红色区域为肌动蛋白。图片来源:Jordi Recasens/Izasa Scientific。

成像增强
显微镜的最终目标是获取优质的图像。然而,由于光毒性的影响,样品观测对实验来说至关重要。通过提升LED的固有属性可以同时改善图像信噪比以及成像的反作用。
金属卤素灯引入后,充液灯开始广泛使用,消除了为提高照明均匀度而校准灯泡的需要。这种均匀度的改善为制造性能良好的光扰频器起到了指导性作用。LED由于其固态特性可以直接与显微镜连接,无需重新校准,并采用柯勒(Köhler)照明——一种现代科学光学显微镜样品照明技术。利用这种方法,光源中的光学器件可将LED成像到显微镜物镜的后孔径上。这种反向工作的物镜能够在样品的完整视野内均匀地分散光线。然而一些LED仍与导光板一起使用,以减轻显微镜的重量和振动。
具有良好的阻挡和反射区域的滤光片能够改善图像的信噪比。在用于普通4',6-二脒基-2-苯基吲哚荧光(DAPI)成像(图4)的激发和发射滤光片中,激发滤光片需要阻挡汞(Hg)光谱大部分蓝色区域的能量。

图4表示使用示例性的激发和发射滤光片覆盖385nm LED的光谱以及DAPI吸收和发射的Hg光谱。

相比之下,用于激发DAPI的LED在相应的激发带上产生了极低的能量,包括在相对较弱的样品成像的蓝色区域。对比结果为,使用LED作为光源能够获得更好的图像信噪比,因为LED光源能够减低样品的背景水平。爱丁堡大学的Sandrine Prost及其同事们的研究表明采用波长可控制的独立LED光源,其信噪比的提高超过了灯泡系统,甚至超过了其他一些白色宽光源LED。
由于细胞不能暴露在高强度光下,因此观测样品也会影响到观测结果。观测样品导致的反作用包括光漂白和光毒性,导致随着时间推移信号减弱和活细胞的死亡或由照明引起的操作不当。减少样品的照明时间对降低这些反作用的影响至关重要。传统灯泡光源通过机械快门来控制曝光,这种方法有时会造成长时间的延迟,导致样品在曝光时被不必要地照亮。
使用自动控制的LED光源则可以解决这个问题。LED的直接TTL控制通过提供以微秒计算时间的开/关来完善USB通信方式。许多高端摄像机在相机曝光时使用TTL输出信号,该信号能够与相机曝光精确配合,直接馈送至LED光源控制开关。由于两至三个荧光标记的顺序成像很常见,所以最新的LED将波长的阶跃序列编程到光源中,随着每个照相机的顺序进行曝光。对于这种电路连接方式,不需要实时操控机械控制的快门以及电脑控制模块,因而减少了不必要地样品曝光。
最近,麦吉尔大学的Claire Brown及其同事们的研究表明,通过控制样品曝光量,光漂白及光毒性的影响将大大降低。一个荧光原子吸收一个光子后将进入受激单能态,理论上将释放自身大部分的能量,激发出一个更长波长的新光子。然而,荧光原子也有可能进入有毒的三线态。如果处于三线态的荧光原子吸收了更多的光子,则额外的能量会使共价键的断裂。这种方法同样有助于降低光毒性和光漂白效果。

 
 
在使用快速线扫描法(可用于共焦系统)的激光激发研究中,光漂白和光毒性的影响同样被显著降低。因为短时间内受限的脉冲在曝光后进入间歇周期,使三线态的分子能够返回到稳定的基态。这方面的研究工作将继续进行,由于LED的可控性以及快速开关切换能力,预期以LED作为光源也能得到相似的结果

340nm的大功率LED已经在近期投入市场使用,其采用钙荧光指示剂(Fura-2)进行钙成像。该应用通过获取神经元网络的活动信息进行阿尔兹海默病及其他相似病症的研究。斯特拉思克莱德大学的Peter Tinning及其同事们的研究表示,使用340nm或380nm的强LED系统可以使细胞中钙荧光指示剂浓度比标准细胞制备方案低25%。
该研究不仅为实验研究节省了资金,更重要的是,能够降低荧光标记可能导致的细胞毒性效应,以观测到生物样品更为典型的自然行为

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