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荧光成像效果不理想?您需要选择合适的光源

发布时间:2019-08-19 浏览量:48

荧光显微镜是利用特定波长的激发光照射被检物体产生荧光进行镜检的显微光学观测技术,已有 100 多年历史。在生物医学领域应用广泛,大多数实验室都有配备高端或者常规的显微成像系统,荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发荧光,荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。

近年来,各种新型荧光染料及各种专业化的荧光探针不断出现,例如:荧光原位杂交(Fluorescent in Situ Hybridization, FISH)相关试剂盒,市场上出现的探针就有十数种之多,Vysis mFISH 探针试剂盒(FITC, CY5, TxR, DEAC, SP-Gold)、Abbott-FISH 探针试剂盒(Spectrum Blue, Spectrum Aqua, Spectrum Green, Spectrum Gold, Spectrum Orange)、Zytovision FISH 探针试剂盒(ZyBlue, DAPI, ZyGreen)、Cytocell FISH 探针试剂盒。其染料的谱线范围各有差异,如何配置合适的荧光显微镜以获得最佳荧光检测效果是一个较为复杂的问题。一直致力于为客户提供定制化的荧光显微镜成像系统,本文将结合客户反馈及自身经验,简单总结如何选择合适光源以获得优质的检测结果。

 


 

一 . 荧光显微镜简要原理
荧光显微镜的基本构造通常由普通光学显微镜再加一些如荧光光源 、激发滤片、双色束分离器及阻断滤片等附件的基础上组成。同时采用的荧光光源一般为超高压汞灯,它可发出各种波长的光,且每种荧光物质都会有一个产生最强荧光的激发光波长 ,这时需加置激发滤片,通常有紫外、紫色、蓝色及绿色激发滤片,仅需使一定波长的激发光透过并照射到标本上,并将其他光都吸收掉。
 

二.影响到荧光显微镜成像效果的因素
影响荧光显微镜成像的荧光因素很多,主要包括:荧光样品的制备,荧光光源的选择,滤片转盘的设计,荧光滤片的组合策略(激发光滤片,发射光滤片,双色镜分光滤片,带宽选择),显微镜物镜种类,显微镜摄像系统的选择等问题。荧光的激发、滤光、成像、淬灭,荧光实验的调整就是怎么才能协调好以上因素得到最好的效果,其中影响到成像效果的一个重要因素即是荧光光源。
 

 
三.荧光显微镜光源种类及介绍
荧光显微镜的常用光源通常都是白光光源:高压汞灯,氙灯,金属卤素灯和 LED 白光光源以及高端的 LED 单波长光源。
1、汞灯
超高压汞灯(50-200W),它是用石英玻璃制作,中间呈球形,内充一定数量的汞,工作时由两个电极间放电,引起汞蒸发,球内气压迅速升高,当汞完全蒸发时,可达 50~70 个标准大气压力,这一过程一般约需 5~15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使汞分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光,足以激发各类荧光物质,因此,为荧光显微镜普遍采用。推荐产品:欧司朗 50W,103W,200W 汞灯,适用于各大厂家高端荧光显微镜;一般 200 小时寿命。

 

2、氙灯
氙灯和汞灯做为白光源,都能提供从紫外到近红外一系列波长的光,但它们却有着不同的激发光谱。汞灯集中在近紫外、蓝光以及绿光附近,这种在峰值的高激发能量确保产生明亮的荧光信号,但光毒性却很强。因此,HBO 用来对固定样品或弱荧光成像。相比而言,氙灯光源的激发比较平缓,可以用于不同波长间强度的比较,例如用于钙离子浓度测量等。氙灯的强激发在近红外 800-1000nm。

XBO 较 HBO 的优势:
1)光谱强度更均匀
2)在红外及中红外仍有较强光谱强度
3)能量较强更易到达物镜后孔径
此类产品:XBO 75W,100W 氙灯;寿命一般 400 小时,1200 小时

3、金属卤素灯
目前各大显微镜品牌广泛使用的一种光源,它和汞灯的激发光谱很像,但它和显微镜以光纤相连,能散热,寿命更长。光纤从光源连到显微镜上,可以大量减少光产生的热能。金属卤素灯对活细胞成像的另一个优势是内置强度设计装置,可以容易调节激发光。也可以通过选择直接连接获得更好的激发效果。例如:EXCELITAS 公司 X-cite 光源,120W,适用于各大厂家高端荧光显微镜;寿命 2000 小时以上。

 
    

4、LED 白光荧光光源
这种光源的开关在毫秒间,减少样品在光照下的暴露时间,延长寿命。另外,LED 光的衰减即快又精确,长期活细胞试验下可大大减少光毒性。和白光相比,LED 仅仅在一个较窄的光谱激发,多个 LED 波段使得 LED 光源能为多色荧光提供应用。例如:EXCELITAS 公司 X-cite 120LED/LED MINI 光源,CoolLED 荧光光源系列,PE 300 Lite/Ultra 等系列。可以采用插入特定滤片及采用外部控制器并且提供 SDK 软件用于二次开发,方便整合到荧光显微镜系统控制。

 

优点
  • 寿命长,衰减慢,通常不需要更换灯泡及校准
  • 控制方便,通常配备有外部控制器
  • 能进行特定波长开关,减少荧光串色及荧光淬灭
  • 结合多色带通滤片组的选择可实现无转盘设计,减少震动
缺点
  • 光谱曲线的某些激发强度不如汞灯和金属卤化物光源,某些波段激发强度不够。例如:CY7,DAPI 染料强度比汞灯和金属卤化物灯弱。
光谱曲线对比
 

 
寿命对比,LED 25000 小时以上
 

 
新产品:EXCELITAS 公司 2018 年 6 月最近新推出 X-Cite® XYLIS LED 光源,可以很好的解决这个问题,全光谱 360nm-770nm, 覆盖从 DAPI 到 CY7 的荧光染料,TRITC/TxRd/mCherry 的荧光探针表现优异,尤其适合 FISH 和体式荧光显微镜观察。先进的控制系统可以采用 USB/TTL/SpeedDIAL 控制,还可以采用脚踏板控制,操作方便。此光源 UV LED 部分还具有 DAPI 365nm 和 385nm 两种型号,更加适合 DAPI 激发,并且具有 UV-OFF 模块降低背景噪音,考虑周到!
 

输出光谱比较
 

5、LED 单波长荧光光源
此类光源属于高端的荧光光源,价格昂贵,通常需要 20000 美元左右哦。采用单波长 LED 模块设计,输出单个波长的荧光谱线,例如 365nm/488nm/561nm/633nm, 类似于激光光源。此类优点突出;寿命长,采用光电快速切换,有效避免物理震动。LED 单模块光源的单色性好,极大的降低了白光光源的背景噪音,高效激发。程序控制适合整合到高端的成像系统中。例如:EXCELITAS 公司 X-CITE TURBO 系统,蔡司公司的 Colibri LED 光源即属于此类代表,寿命普遍在几千个小时。

 
    
 
适用染料 LED模块波长(nm)
DAPI 385
CFP 430
GFP / FITC 470
YFP 510
TRITC / Cy3 / RFP / mCherry 560
MitoTracker Red CMXROS 580
Cy5 640

四. 总结
荧光显微镜在过去的十几年中以惊人的速度升级迭代,与荧光显微镜密切相关的荧光染料及探针不断被发明。光电技术发展同样迅速,创新的激光共聚焦成像技术,多光子成像技术,脉冲激发技术,高灵敏度固态探测器,高数值孔径物镜和各种不断开发出来的基于计算机图像分析方法,帮助生物医学研究者进一步深入调查基于荧光的生物现象,让研究者深入探究在自然环境中在活细胞内。同时免疫荧光在医学研究、诊断领域里的广泛应用,FISH、各种荧光蛋白技术分别在基因组学、蛋白质组学研究方面的推广,生物医学科研对仪器需要越来越高,先进的的荧光仪器和配件的发展将毫无疑问地继续。

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