细胞迁移在许多复杂的生理和病理过程中起着重要作用。伤口愈合测定是研究体外细胞迁移的简单方法。该测定基于以下观察：当在汇合细胞单层上产生人工间隙时，所产生的间隙边缘上的细胞将迁移直至建立新的细胞。ibidi Culture-Insert 系列为伤口愈合实验提供了完整的解决方案，从样品制备到图像分析只需要几个步骤。
本应用简报是使用 ibidiCulture-Insert 2 Well 分析 MCF-7 细胞迁移行为的详细方案。

图 1   使用 ibidi Culture-Insert 2 Well 进行伤口愈合测定的实验工作流程

ibidi Culture-Insert 2 Well 放置在细胞培养表面上，提供两个细胞培养容器，每个容器由 500μm 壁隔开。在两个储库中填充细胞悬浮液仅允许细胞在指定区域生长。移除培养插入物 2 在适当的细胞附着后，产生大约 500μm 的无细胞间隙。显微镜用于评估伤口愈合过程。根据您感兴趣的焦点，可以通过使用视频显微镜或通过在不同时间点观察图像来完成。测量细胞覆盖区域的变化允许量化伤口闭合的速度并提供细胞迁移特征。

实验工作流程也可以应用于 Culture-Insert 3 Well 和 Culture-Insert 4 Well。他们的区别是更多的孔和相应的更高数量的无细胞间隙。

1.  材料

• 细胞：                              MCF-7 (ATCC: HTB-22; DSMZ:ACC115)
• 同一实验软件:                   2 孔插件放在 35 毫米的培养皿中，高壁（ibidi，80206）
• 细胞培养表面：                 ibidi ibitreat
• 细胞培养基：                    RPMI (西格玛，R8758) = 10% FCS (西格玛,  F0804)
• 细胞解离溶液：                 胰蛋白酶-ETDA（Sigma，59418C）
• 无菌镊子
• 倒置显微镜，最好具有自动图像采集系统和用于活细胞成像的阶段顶部培养箱

实验工作流程
步骤 1：细胞接种

为了建立可靠的数据采集系统，您必须在开始实验之前定义实验参数。这包括例如选择正确的细胞接种密度。我们建议使用 24 小时后产生 100％ 光学汇合细胞层的密度。

1. 像往常一样准备细胞悬液。建议包括离心步骤以去除死细胞和细胞碎片。将细胞悬液调节至合适细胞浓度。在 24 小时后获得 3×105 细胞/ ml以获得汇合的细胞层。

2. 将 70μl 细胞悬浮液应用于 Culture-Insert2 孔的每个孔中。避免摇动 μ-Dish，因为这会导致细胞分布不均匀。

3. 将细胞在 37°C 和 5％CO2 下孵育至少 24 小时

图 2   在 ibidi Culture-Insert 2 Well 中接种细胞

第 2 步：间隙形成

汇合细胞层是开始该测定的先决条件。去除 Culture-Insert 2 孔后加入新鲜培养基。如有必要，补充培养基中的抑制或增强物质，以评估其对细胞迁移行为的影响。

1. 在显微镜下 24 小时后检查细胞密度。如果在 24 小时后没有达到汇合的细胞层，则将 μ-Dish 再次置于细胞培养箱中 12-24 小时，定期检查汇合点。

2. 用无菌镊子轻轻取出 Culture-Insert 2 孔。如图 3 所示，删除 Insert 一角

图 3   使用无菌镊子去除 ibidi Culture-Insert 2 孔

3. 移除插入后，检查您的细胞层是否仍附着在 μ-Dish 的表面上。

4. 用无细胞培养基或 PBS 清洗细胞层，去除细胞碎片和非附着细胞。

5. 使用推荐体积为 2 ml 的无细胞培养基填充 μ-Dish

图 4   由 ibidi Culture-Insert 2 Well 创建的无细胞间隙

第 3 步：获取显微镜图片

我们建议录制延时视频，以确定时间依赖性和细胞迁移的特征。

1. 将培养皿放在显微镜上并移动它直到你有间隙，并在图像中捕获两个细胞前端。使用 4x / 5x 或 10x 物镜。伤口区域的方向并不重要，但需要水平或垂直。

2. 在接下来的几个小时内多次拍摄图像，开始观察过程。

3. 在 ibiTreat 表面上培养的 MCF-7 细胞的时间推移测量进行 20 小时，时间间隔为 30 分钟。

图 5   使用 MCF-7 细胞的迁移测定的时间流逝测量（比例尺：200μm）

步骤 4：使用 ACAS 和数据解释进行定量图像分析

必须分析显微照片以获得关于培养细胞的迁移特征的信息。这可以通过使用图像处理软件手动完成，也可以使用自动图像分析完成自动细胞分析系统（ACAS）由 ibidi 提供。

使用 ACAS 分析此处显示的示例数据。自动图像分析检测细胞覆盖区域。相对于时间绘制细胞覆盖区域显示了间隙闭合的过程。线性相可用于表征迁移（=伤口闭合的速度）。

线性相的斜率显示平均刮擦闭合速度为 0.0184×106μm2/ 小时（= 0.44×106μm2/ 天）。

图 6   ACAS 伤口愈合实验的定量图像分析